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影響HPLC保留時(shí)間漂移因素有哪些?如何解決?

更新時(shí)間:2020-09-14 點(diǎn)擊次數(shù):4084

 

Hello,大家好,小編又和大家見面了。在前期內(nèi)容中,大家已經(jīng)了解氣相色譜法、SPE固相萃取技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。那么,今天小編就帶大家了解另外一種分離分析技術(shù)——HPLC(高效液相色譜法)。

 

HPLC

HPLC是20世紀(jì)60年代末開始發(fā)展起來的新型高效分離分析技術(shù),是以液體為流動(dòng)相,可以解決沸點(diǎn)高、難氣化、熱穩(wěn)定性差、極性強(qiáng)的化合物分析。但在使用過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)化合物保留時(shí)間重現(xiàn)性不好的現(xiàn)象,一般有兩種情況,即保留時(shí)間波動(dòng)和保留時(shí)間漂移。前者是指保留時(shí)間沒有固定規(guī)律的變化,而后者指保留時(shí)間沿著單方向發(fā)生改變。保留時(shí)間波動(dòng)往往與儀器檢測(cè)條件、泵穩(wěn)定性密切相關(guān),保留時(shí)間漂移一般是由色譜柱老化、柱效變差所引起。

 

今天,我們就詳細(xì)地了解一下,影響保留時(shí)間漂移的因素有哪些?以及該如何解決?

 

 

如若發(fā)生保留時(shí)間漂移,首先需要考慮流動(dòng)相是否已使色譜柱達(dá)到充分的平衡。一般情況下,流動(dòng)相平衡色譜柱需要10-20個(gè)柱體積;但如果流動(dòng)相中有使用弱酸、弱堿、緩沖鹽和離子對(duì)試劑,則需要更長(zhǎng)的時(shí)間來平衡色譜柱。還有可能是流動(dòng)相受到污染(水是容易受到污染的流動(dòng)相成分),存在于流動(dòng)相中的小分子污染物會(huì)在色譜柱中慢慢富集,從而也會(huì)造成保留時(shí)間的漂移。

 

 

不同填料、不同鍵合相的色譜柱,其固定相的穩(wěn)定性也有所區(qū)別。如:普通硅膠填料色譜柱的耐受pH范圍為2-8;聚合物基質(zhì)色譜柱耐受pH范圍在1-14;有機(jī)無機(jī)雜化硅膠填料的耐受pH范圍能達(dá)到1-12.5。即使在推薦的pH范圍內(nèi)使用色譜柱,隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加,使用時(shí)間的延長(zhǎng),也會(huì)造成鍵合相的水解脫落。水解速度與所使用的流動(dòng)相類型和配體有關(guān)。相比于單官能團(tuán)配體,雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體的鍵合相更加穩(wěn)定;長(zhǎng)鏈鍵合相比短鏈鍵合相要穩(wěn)定;烷基鍵合相比氰基鍵合相更加穩(wěn)定。

 

色譜柱也是分析試驗(yàn)中的耗材,所以在使用過程中需要按照說明書進(jìn)行相關(guān)維護(hù)。當(dāng)保留時(shí)間漂移嚴(yán)重時(shí),很有可能是色譜柱壽命已到,需要及時(shí)進(jìn)行更換。

 

在分析試驗(yàn)中,液相色譜柱不但會(huì)吸附待測(cè)組分,同時(shí)也會(huì)對(duì)流動(dòng)相攜帶的其他物質(zhì)產(chǎn)生吸附。造成色譜柱污染的來源可能是:流動(dòng)相試劑瓶、流動(dòng)相本身、儀器連接管路、進(jìn)樣器、泵和密封墊,以及樣品本身所攜帶的雜質(zhì)。樣品基質(zhì)中如果含有保留性很強(qiáng)的污染物,就可能是待測(cè)組分保留時(shí)間產(chǎn)生漂移的根源。如:環(huán)境水樣中的腐殖酸、血清中的蛋白和脂類化合物以及配藥中的賦形劑等。這些樣品中的污染物會(huì)在色譜柱的前端進(jìn)行富集,導(dǎo)致保留時(shí)間漂移,同時(shí)也會(huì)伴有柱壓的升高。

 

可以通過SPE、QuEChERS等前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行凈化,去除樣品中的雜質(zhì)和污染物。此外,可以通過使用保護(hù)柱來避免污染物與分析柱的直接接觸,或者通過反沖色譜柱來除去污染物(月旭科技絕大多數(shù)色譜柱都可以進(jìn)行反沖)

 

 

流動(dòng)相組成成分的變化也會(huì)引起保留時(shí)間的漂移,如流動(dòng)相中易揮發(fā)組分的流失、變質(zhì)等。 

 

 

于進(jìn)行過封尾處理的反相色譜填料,當(dāng)使用接近100%的水為流動(dòng)相時(shí),會(huì)發(fā)生分離突然喪失、待測(cè)組分保留減弱,甚至不保留的現(xiàn)象,此種情況就是疏水坍塌。原因是100%的水相不能浸潤(rùn)反相色譜填料,挽救的辦法是先用含大量有機(jī)相的流動(dòng)相浸潤(rùn)色譜柱,再用分析流動(dòng)相進(jìn)行平衡。色譜柱長(zhǎng)期儲(chǔ)存也會(huì)發(fā)生此種現(xiàn)象。使用嵌有極性基團(tuán)的反相柱(如Ultimate polar-RP)或者未進(jìn)行封尾處理的色譜柱可以有效避免發(fā)生坍塌現(xiàn)象。

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