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2020版藥典中新增的多維液相色譜究竟是“何方神圣”?

更新時(shí)間:2019-09-25 點(diǎn)擊次數(shù):3626

2020版藥典液相色譜法中新增了多維液相色譜,各位不了解的小伙伴快來看看吧

 

一維液相色譜的劣勢(shì)

色譜作為復(fù)雜混合物的分離工具,對(duì)化合物的分離分析發(fā)揮了很大的作用。目前使用的大多數(shù)儀器為一維色譜,使用一根柱子,適合于含幾十至幾百個(gè)物質(zhì)的樣品分析。當(dāng)樣品更復(fù)雜時(shí),例如有人分析鹿茸蛋白,得到上千個(gè)色譜峰,可是經(jīng)質(zhì)譜定性表明,平均每個(gè)峰又含有二個(gè)組分,就要用到多維色譜技術(shù)。

 

多維液相色譜的優(yōu)勢(shì)

多維液相色譜又稱為色譜/色譜聯(lián)用技術(shù),是采用匹配的接口將不同分離性能或特點(diǎn)的色譜連接起來,di一級(jí)色譜中未分離或需要分離富集的組分由接口轉(zhuǎn)移到第二級(jí)色譜中,第二級(jí)色譜仍需進(jìn)一步分離或分離富集的組分,也可以繼續(xù)通過接口轉(zhuǎn)移到第三級(jí)色譜中。

 

理論上,可以通過接口將任意級(jí)色譜串聯(lián)或并聯(lián)起來,直至將混合物樣品中所有的難分離、需富集的組分都分離或富集之。但實(shí)際上,一般只要選用兩個(gè)合適的色譜聯(lián)用就可以滿足絕大多數(shù)難分離混合物樣品的分離或富集要求。因此,一般的色譜/色譜聯(lián)用都是二級(jí),即二維色譜。

圖1、二維液相色譜示意圖

 

二維液相色譜分類

在二維色譜的術(shù)語中,1D和2D分別指一維和二維;而¹D和²D則分別代表di一維和第二維。

 

二維液相色譜可以分為差異顯著的兩種類型。若兩種色譜的聯(lián)用僅是通過接口將前一級(jí)色譜中某一些組分傳遞到后一級(jí)色譜中繼續(xù)分離,這是中心切割式二維色譜(heart-cuttingmode two-dimensional chromatography),一般用(LC-LC)表示。當(dāng)兩種色譜聯(lián)用,接口將前一級(jí)色譜中的全部組分連續(xù)地傳遞到后一級(jí)色譜中進(jìn)行分離,這種二維色譜稱為全二維色譜(comprehensive two-dimensional chromatograghy)一般用LC×LC表示。

 

LC×LC是將¹D色譜柱的流出物連續(xù)轉(zhuǎn)移至²D色譜柱。相比之下,LC-LC則是將¹D流出物選擇性地(部分地)轉(zhuǎn)移至²D色譜柱中。此外,這兩種類型下還有若干子類,包括選擇性二維色譜(sLC×LC)和多中心切割²D-LC(mLC-LC)。

 

LC-LC或LC×LC兩種二維色譜可以是相同的分離模式和類型,也可以是不同的分離模式和類型。接口技術(shù)是實(shí)現(xiàn)二維色譜分離的關(guān)鍵之一,原則上,只要有匹配的接口,任何模式和類型的色譜都可以聯(lián)用。

 

和一維色譜一樣,二維色譜也可以和質(zhì)譜、紅外和核磁共振等聯(lián)用。

 

SCX/RP二維液相色譜用于珠蛋白酶解產(chǎn)物分析

圖2、 SCX/RP高通量分析珠蛋白酶解產(chǎn)物

 

??di一維采用SCX強(qiáng)陽離子交換色譜柱,流動(dòng)相A為5mM NaH2PO4+1%乙腈,B為A+1.0mol/L NH4Cl,流動(dòng)相pH4.0。

 

??第二維采用兩支相同的C18常規(guī)反相色譜柱,流動(dòng)相A為含0.1%TFA的水溶液,B為含0.1%TFA的乙腈。

 

樣品進(jìn)入陽離子交換色譜,由SCX流動(dòng)相逐步增加鹽濃度間斷洗脫,通過接口的有效轉(zhuǎn)移將SCX洗脫的產(chǎn)物導(dǎo)入第二維反相色譜中進(jìn)一步分離。

 

在選定實(shí)驗(yàn)條件下的二維分析結(jié)果,在離子交換色譜和反相色譜構(gòu)成的二維液相色譜系統(tǒng)中,因離子交換色譜較高的柱容量通常作為di一維系統(tǒng),而反相色譜與離子交換色譜流動(dòng)相有較好的兼容性及較高的分辨率常作為第二維系統(tǒng)。

 

由于SCX對(duì)樣品的切割分離,二維分離的結(jié)果大大降低了樣品分析的復(fù)雜性。同時(shí)由于二維分離機(jī)理的正交性,進(jìn)一步拓寬了樣品的分離空間,增強(qiáng)了系統(tǒng)的分離能力。在分析珠蛋白酶解產(chǎn)物中,di一維離子交換切割次數(shù)為19次,由圖2可知第二維反相色譜峰容量為174,這種臺(tái)階式洗脫切割方法峰容量為di一維切割次數(shù)乘以第二維峰容量,因此SCX/RP二維液相色譜的峰容量可達(dá)到3306。

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