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凝膠柱的選擇與凝膠的預處理

更新時間:2022-03-15 點擊次數(shù):3320

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凝膠柱的選擇

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在選擇凝膠柱時,從外觀、質(zhì)地結(jié)構(gòu)和性能來講,所選柱子要透明光滑,內(nèi)徑一致,耐壓防腐,柱子物料須生物兼容,并有良好的物理化學抗性和穩(wěn)定性。一般的柱材料多為玻璃或有機玻璃,在使用鋼柱時,特別要注意防腐蝕。另外,柱子終端要有采集器和過濾網(wǎng),柱底板要求耐壓且不容易堵塞。死體積應小于0.001Vt,如果死體積過大,被分離組分可能會重新混合,導致洗脫峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,降低分辨率。底板過濾介質(zhì)要求新,且?guī)в心芘c凝膠融合的網(wǎng)孔,避免接觸網(wǎng)孔和過濾介質(zhì)的表面,因為指紋會使樣品的分離程度下降。在裝柱或重新裝柱時,所有部位必須*清洗干凈。

凝膠柱的長度和內(nèi)徑主要取決于加樣體積的多少和對分辨率的要求。凝膠柱的長度對分辨率的影響較大,長柱的分辨率要比短柱的高,但過長會引起柱內(nèi)不均一、liu速過慢,柱長度一般不超過100cm。同時,也要有適當?shù)闹鶅?nèi)徑,內(nèi)徑過粗會產(chǎn)生蛋白樣品較為嚴重的橫向擴散現(xiàn)象,內(nèi)徑過細,靠近柱內(nèi)壁的流速會大于中心的流速,產(chǎn)生“器壁效應",影響分離速度和效果。通常使用的凝膠柱長度在25-70cm,內(nèi)徑在4-16mm,H/D(高徑比)一般在 (25:1)-(100:1)之間。用于組別分離的凝膠柱,其H/D 可相對低一些;進行分級分離時H/D可在(30:1)-(100:1);而脫鹽柱由于對分辨率的要求較低,一般用短柱,H/D大多在(5:1)-(25:1)之間。如果要分離的蛋白質(zhì)分子量相差較大,可選用H/D=(15:1)-(50:1)的柱子,且柱體積要大于4-15倍的樣品體積;如要分離的蛋白質(zhì)分子量差異較小,則選用H/D=(20:1)-(100:1)的細柱,且柱體積要大于25-100倍的樣品體積。在純化蛋白質(zhì)時,為了得到較好的分辨率,柱子的H/D 應在(20:1)-(40:1)。

此外,選擇柱子時還應考慮凝膠顆粒的大小。如填裝小顆粒凝膠,適合使用較大直徑的色譜柱;用粗顆粒填裝時,則用較小直徑的柱子。


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凝膠的預處理

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市售凝膠一般呈干粉顆粒狀(如 Tandex) 或水懸浮狀 (如Tanrose CL)。一些不宜在脫水干燥狀態(tài)下保存的凝膠 (如瓊脂糖凝膠),應存放在含防腐劑的水溶液中,這些凝膠在使用前不需要進行溶脹處理。另外,多孔硅膠和多孔玻璃也不需要溶脹處理。為了盡量減少不同溶劑對柱床體積的影響,獲得理想的分離效果,應將干膠緩慢倒入5-10倍干膠體積的洗脫液中充分溶脹。若溶脹不夠,則達不到有效的分離,而且在使用過程中會引起凝膠柱破裂。

根據(jù)蛋白質(zhì)樣品的分子量和分辨率要求選擇好所用凝膠的類型后,再根據(jù)柱體積和凝膠的吸水性質(zhì)估算出干膠的用量。由于凝膠在預處理和實驗操作過程中有一定量的損失,所以在實際稱取時應高于理論計算值的10%-20%。


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不同類型的凝膠所需的溶脹時間不同。一般型號較小、排阻極限較低的凝膠,其吸水量較低,溶脹所需時間較短,在20℃條件下需3-4h即可;型號較大、排阻極限較高的凝膠,其吸水量較大,故所需的溶脹時間也較長,在20℃左右需十幾小時到幾十小時。

加熱溶脹是常用的凝膠預處理方法,即把所稱量的凝膠干粉溶在洗脫液中逐漸加熱至接近沸騰。這種方法可大大縮短溶脹時間,一般在1-2h內(nèi)即可完成,而且可起到溶脹、除氣和殺菌的三重效果。在凝膠溶脹過程中要不斷緩慢攪拌,但不能劇烈攪拌,因為這樣容易引起凝膠顆粒的破碎,最終使細小顆粒堵塞凝膠柱而影響到流速和分離效果。此外,還應盡量避免在酸或堿中進行加熱溶脹,以防破壞凝膠的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。

待充分溶脹后,應將凝膠勻漿懸浮,看上清中是否有雜質(zhì)或不均一的細小顆粒,如有則需反復傾倒去除,直至上清液不再渾濁為止。對溶脹后的凝膠進行除氣泡是非常重要的,否則也會影響分離效果,一般可通過真空抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。由于凝膠價格昂貴,在使用過程中要盡量減少損失和浪費,剩余凝膠要保存好,以備后用。

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