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考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量

更新時間:2022-02-07 點擊次數(shù):22580

考馬斯藍染色法又稱Bradford法,是Bradford于1976年建立起來的一種蛋白質(zhì)濃度的測定方法??捡R斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色,最大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?,蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。


實驗儀器

分析天平、燒杯、玻璃杯、移液槍、紫外分光光度計或酶標儀。

實驗試劑

標準蛋白溶液:常用牛血清蛋白(BSA),配制1mg/mL的標準溶液。

0.01%考馬斯亮藍染色液G-250:稱取0.01g考馬斯亮藍G-250,溶于95%乙醇中,加85%(m/V)的磷酸10mL,最后用超純水定容至100mL,裝入棕色瓶中保存。(不宜久存,室溫1-2個月)

實驗步驟

紫外分光光度計測定


微信截圖_20220207162955.png

將表格所示溶液加入試管中充分混勻,10min后倒入比色皿,放入紫外分光光度計于595nm測定吸光值,1號管作為空白對照,以蛋白濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標曲作為定量依據(jù)。

②樣品測定

取含10-100μL蛋白質(zhì)溶液于小試管中,加水稀釋至0.1mL,然后加入5mL G-250蛋白染色液,充分混勻,10min后倒入比色皿,放入紫外分光光度計于595nm測定吸光值,1號管作為空白對照,將測得吸光值帶入標準曲線計算樣品中的蛋白質(zhì)含量。


酶標儀測定


微信截圖_20220207163052.png

將表格所示溶液依次加入酶標板中混勻,靜置10min后,放入酶標儀中于595nm測定吸光值,A孔作為空白對照,以蛋白濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標曲作為定量依據(jù)。

②樣品測定

取含4-40μL蛋白質(zhì)溶液于酶標板中,加水稀釋至40μL,然后加入250μL G-250蛋白染色液,充分混勻,靜置10min后,放入酶標儀于595nm測定吸光值,A孔作為空白對照,將測得吸光值帶入標準曲線計算樣品中的蛋白質(zhì)含量。


注意事項

通常會將樣品稀釋多個梯度進行測定,防止樣品測得吸光值過高,超出標曲導(dǎo)致的含量計算偏差。

樣品中若含有去污劑,如TritonX-100、SDS等,會嚴重干擾測定結(jié)果。

比色反應(yīng)需在1h內(nèi)完成,如果測定要求很嚴格,可以在染色液加入后的5-20min內(nèi)測定吸光值,因為在這段時間內(nèi)顏色是zui穩(wěn)定的。

測定時,蛋白-染料復(fù)合物會有少部分吸附在比色皿杯壁上,測試完后可用乙醇溶液將比色皿中的殘留物沖洗掉,再用超純水沖洗干凈保存。


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