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Co柱常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

更新時(shí)間:2021-12-07 點(diǎn)擊次數(shù):1995

在水溶液中,過(guò)渡金屬離子(如Zn2+、Cu2+、Ni2+和Co2+)與組氨酸和半胱氨酸間具有親和作用,IMAC正是以此親和力為基礎(chǔ)。將此方法延伸應(yīng)用,使金屬離子“強(qiáng)固定"于載體達(dá)到蛋白質(zhì)分級(jí)分離的目的。

應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用目的選擇固定于IMAC配基的金屬離子。三價(jià)陽(yáng)離子,如Al3+、Ga3+和Fe3+或四價(jià)Zr4+更適合捕獲磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化肽,二價(jià)Cu2+、Ni2+、Zn2+和Co2+常用于純化His標(biāo)記蛋白質(zhì)。聯(lián)合使用四配位配基,可以確保固定化牢固,而且金屬離子(Ni2+、Co2+)保留兩個(gè)自由配位鍵與生物高分子相互作用時(shí),接受能力更高,同時(shí)回收率和洗脫蛋白質(zhì)純度無(wú)明顯變化。

月旭金屬螯合親和介質(zhì)主推Ni(NTA/IDA)、Co(NTA),今天主要介紹下Co Tanrose 6FF(NTA)的基本參數(shù)與常見(jiàn)問(wèn)題。


  • Co Tanrose 6FF (NTA)

Co Tanrose 6FF(NTA)是以高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì),氨三乙酸偶聯(lián)于瓊脂糖而成,之后螯合Co2+。鈷NTA瓊脂糖凝膠FF特異性好,螯合鈷更穩(wěn)定,不易脫落,能耐受更高的還原劑,物理和化學(xué)穩(wěn)定性好。

  • 產(chǎn)品參數(shù)


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柱子反壓高


原因分析:

1、填料被堵塞

解決方案:①裂解液中含有微小的固體顆粒,建議上柱前使用濾膜(0.22或0.45μm)過(guò)濾,或者離心去除。

②樣品中含有高濃度的核酸,加長(zhǎng)破碎時(shí)間直至粘度降低,或者添加DNase I(終濃度5μg/ml),Mg2+(終濃度1mM),冰上孵育10-15分鐘。

2、樣品太粘稠

解決方案:有機(jī)溶劑或者蛋白穩(wěn)定試劑(如甘油等)可能會(huì)引起反壓增高,降低操作流速。

No.2

洗脫組分中沒(méi)有目的蛋白

原因分析:

1、蛋白可能是包涵體,不在上清中

解決方案:可以通過(guò)電泳檢測(cè)裂解液分析上清中是否含有目的蛋白,包涵體蛋白需要按照包涵體蛋白的純化方式。

2、表達(dá)量太低

解決方案:優(yōu)化表達(dá)條件。

3、目的蛋白結(jié)合比較弱,在洗雜步驟被洗下來(lái)了

解決方案:提高Wash Buffer的pH,或者降低咪唑濃度。

4、目的蛋白結(jié)合過(guò)強(qiáng),不容易洗脫下來(lái)

解決方案:降低Elution Buffer的pH值,或者增加Elution Buffer中咪唑濃度。

5、蛋白降解

解決方案:菌體破碎時(shí)添加一些蛋白酶抑制劑。在4°C下進(jìn)行純化操作。 

No.3

洗脫組分不純(含有多種蛋白)

原因分析:

1、洗雜不*

解決方案:增加Wash Buffer體積。

2、樣品中含有其他的組氨酸標(biāo)簽蛋白

解決方案:通過(guò)調(diào)節(jié)pH值,或者咪唑濃度來(lái)優(yōu)化洗雜條件。再使用其他的純化手段(如離子交換、疏水等)進(jìn)一步純化洗脫組分。

No.4

填料呈現(xiàn)褐色

原因分析:

緩沖液中含有DTT等還原劑

解決方案:適當(dāng)降低還原劑DTT的濃度,或者改用巰基乙醇。

No.5

上樣過(guò)程中蛋白發(fā)生沉淀

原因分析:

1、操作溫度太低

解決方案:室溫下進(jìn)行上樣。

2、蛋白發(fā)生聚集

解決方案:在樣品和所有的緩沖液中添加穩(wěn)定劑,如0.1%的TritonX-100或者Tween-20。

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