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色譜圖出現(xiàn)雙峰了?別慌,給我三分鐘幫你解決!

更新時間:2020-05-16 點擊次數(shù):19509

各位小伙伴在做實驗過程中通常會遇到各種奇奇怪怪的問題,其中色譜峰出現(xiàn)雙峰可以說是經(jīng)常會遇見的一類問題。遇見雙峰了該怎么去解決呢,這里聽小編慢慢道來。

 

 

HPLC分析中,在色譜柱正常,樣品靈敏度足夠,分析方法合適,色譜峰在出峰時間較短的條件下(不包括梯度),峰型應(yīng)對稱而尖銳。但是,在對樣品了解程度不夠,方法不妥,樣品處理方法及進樣方式不合理下,會出現(xiàn)各種意想不到的問題,而對色譜峰難以作出合理的解釋,尤其對于新手更是如此。色譜雙峰指的是一種物質(zhì),但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰,這種情況分為四種原因。

 

1.色譜柱堵塞或污染

 如果你分析樣品時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都出現(xiàn)雙峰(出峰越快,出現(xiàn)雙峰的可能性越少),尤其采用單一純物質(zhì)時,可以判定色譜柱出問題(柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失)。如果進樣量少,原來色譜柱正常,色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰,不一定拖尾,這一般應(yīng)是柱頭端堵塞,將色譜柱反接沖洗維護,一般情況下可以解決。如果峰拖尾,雙峰強弱相差不大,柱頭填料受污染或鍵合相流失可能性更大,這時可以對色譜柱維修處理或者使用新的色譜柱,維修建議交由廠家處理。

 

2.溶劑極性及進樣量不合適

許多小伙伴對此可能不以為然,一般的書籍和文獻都不會提到這方面的內(nèi)容,而這確是雙峰產(chǎn)生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜,流動相多為甲醇、乙腈、水,以及各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解,溶解方法是用流動相溶解,但是很多情況是不一致的。當(dāng)用極性強度大的試劑做溶劑時,如純甲醇、純乙腈,純乙醇,而分析體系中以水為主,樣品進樣量大,如20ul,單一的純物質(zhì)出雙峰,第二峰比第yi峰小(每次都不太一樣),且拖尾,保留時間會提前(相對進樣量少而言),將進樣量減少一半以上,峰型將變?yōu)檎?。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大,而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的。

 

另一個原因是,進樣量不一定大,但濃度很大,色譜圖上的雙峰緊靠在一起,基本上齊高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色譜柱問題)。將樣品稀釋再進樣就可以了,這是由于進樣量過大,色譜柱過載造成的。

 

3.樣品的特性和PH值不了解

有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點,存在互變異構(gòu)現(xiàn)象,而這種互變異構(gòu)體無法分開,而是以一個動態(tài)平衡存在。在色譜分析時,在一個特定的條件下,一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰,甚至三峰。這時一般雙峰靠的很近,基本齊高,不拖尾,條件稍一變化,尤其改變pH,雙峰現(xiàn)象將消失。

 

pH對峰形的影響在緩沖液流動相平衡過程中非常明顯,當(dāng)連續(xù)進樣時,受pH的連續(xù)變化影響會經(jīng)常遇到這種雙峰的情況。另外,在樣品分析時,流動相的pH盡量遠(yuǎn)離被分析物的等電點,否則也容易引起雙峰的產(chǎn)生。在用離子對試劑分析時,選擇不好條件也會容易引起雙峰的產(chǎn)生。

 

4.儀器參數(shù)設(shè)置不合理

參比波長設(shè)置錯誤,例如設(shè)置分析波長254nm,參比波長400nm,這個對于大多數(shù)化合物可能沒影響。但是如果被測化合物,在400nm處也有強的紫外吸收,比254nm更高。這樣其出峰時,由于背景的抵扣作用,本來一個峰會變成對稱的二個峰,而且如果將二峰之間的峰谷反轉(zhuǎn)180度,恰好是一個完整的峰。這時要將參比波長設(shè)置更大,或者取消。

 

以上就是小編給各位小伙伴整理的出現(xiàn)雙峰的原因和對應(yīng)解決方案,高效液相色譜是一套非常精密的分析系統(tǒng),一旦出現(xiàn)異常峰形需要認(rèn)真排查原因,找到合適解決方案。各位小伙伴若還有任何疑問,歡迎咨詢我們的當(dāng)?shù)劁N售或經(jīng)銷商。

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